RESUMO
ABSTRACT In vitro studies on the pathogenesis of the human cytomegalovirus (HCMV) are conducted regularly using laboratory adapted strains that lose some characteristics during the adaptation process. Since HCMV is excreted from bodily fluids during infection or reactivation, this work aimed to isolate and culture HCMV from the MRC-5 human cells found in the urine, bronchoalveolar lavage, saliva, and plasma samples of pediatric patients with probable or confirmed infection. The samples were inoculated on cell cultures either for 14 days or until a cytopathic effect (CPE) of 80 % was observed. The cell lysates and supernatants were used to perform successive viral passages. Besides HCMV, the herpes simplex virus was detected from all the saliva samples. Inoculation of the HCMV positive sera induced cell clustering and immediate monolayer damage that restricted their use. One sample of bronchoalveolar lavage induced a CPE after inoculation like that of the HCMV reference strains (Towne and Merlin), which was consequently propagated and titrated. A second viral isolate derived from the urine sample of a patient with congenital infection did not demonstrate a CPE, although presence of the virus had been confirmed using PCR. The viral isolates were examined and found to be negative for adenoviruses or enteroviruses. Despite the evident difficulty encountered for the isolation and harvesting of the HCMV, this work shows that it was possible to obtain a low passage viral strain using a modified shell vial method and inoculation protocol with extended follow-up and confirmation.
RESUMEN Estudios in vitro de la patogénesis del citomegalovirus humano (HCMV) se hace empleando cepas adaptadas de laboratorio que han perdido algunas de sus características durante ese proceso. En vista que el HCMV se excreta en distintos fluidos corporales, dependiendo de la condición clínica del paciente, en este trabajo se propuso aislar y propagar HCMV en fibroblastos MRC-5 usando muestras de orina, lavado broncoalveolar, saliva y plasma de pacientes pediátricos. Estas muestras fueron inoculadas sobre los cultivos celulares por 14 días o hasta alcanzar un efecto citopático en el 80 % de la monocapa. El lisado celular y el sobrenadante del aislamiento se usaron para hacer pasajes virales sucesivos. Además de HCMV, el virus de herpes simple se aisló en todas las muestras de saliva. Con el empleo de los sueros positivos para HCMV se observó la formación de agregados y daño inmediato en la monocapa que impidieron su uso. Una muestra de lavado broncoalveolar indujo ECP desde la inoculación, similar al control positivo para HCMV (cepas Towne y Merlin), por lo que fue propagada y se tituló. Un segundo aislamiento viral obtenido de la orina de un paciente con infección congénita no produjo ECP a pesar de ser confirmado por PCR. En los aislamientos llevados hasta el pasaje 1, se descartó la presencia de enterovirus y adenovirus. A pesar de la evidente dificultad para aislar y propagar el HCMV, fue posible obtener un aislamiento usando un protocolo de Shell vial e inoculación modificado, y con un seguimiento prolongado del proceso.
RESUMO
Antecedentes: la infección por virus herpes simple tipo 1 (VHS-1) es una de las más frecuentesen la población humana; produce infecciones en mucosa oral, piel, ojos e inclusoen el sistema nervioso, que causa encefalitis. Después de la infección en la región orofacial,este virus puede permanecer en estado de latencia en el ganglio trigémino y eventualmentereactivarse. Objetivo: determinar la presencia de VHS-1 en ganglios trigeminales humanosmediante pruebas paralelas de PCR, RT-PCR e inmunohistoquímica. Métodos: previa aprobacióndel Comité de Ética de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional deColombia y del Instituto de Medicina Legal y Ciencias Forenses, se recolectaron dieciséispares de ganglios trigeminales humanos, que se procesaron tanto para extracción de ácidosnucleicos como para inmunohistoquímica. Resultados: en seis de los ocho donantesanalizados por inmunohistoquímica se encontró marcaje positivo para antígeno de VHS-1.Se halló que nueve de los donantes evaluados por PCR para VHS-1 y cinco de los diezexaminados para transcritos asociados a latencia (LAT) fueron positivos. Conclusión: seencontraron ganglios trigeminales en los que no se detectó virus y otros con distintosestados de infección (activa y latente). En casi todos los ganglios fue evidente el infiltradoinflamatorio asociado. El presente es el primer trabajo en el que se busca sistemáticamentetanto genoma viral como proteínas y transcritos LAT en ganglios trigeminales humanos, locual abre puertas para la investigación tanto de la epidemiología como de los fenómenosasociados a la LAT y reactivación del VHS-1...
Background: Infection by type 1 Herpes Simplex Virus (HSV-1) is the most frequent viralinfection in human population being able to cause injuries in oral mucosa, skin, cornea,and even the central nervous system causing encephalitis. After mucosal infection, HSV-1establishes a lifespan latent infection in trigeminal ganglia where it occasionally reactivatesinfecting primary sites again. It is little known about cell and molecular events responsiblefor infection reactivation and immune response in human ganglia. Objective: To standardizethe obtaining and processing of human trigeminal ganglia to detect specific HSVantigen, DNA and RNA. Methods: After approval of the study by the Universidad NacionalIRB, 32 trigeminal ganglia were obtained from 16 cadavers from the Colombian ForensicMedicine Institute. Results: Using PCR technique to detect viral DNA, it was found that 56.3 %of ganglia (9/16) amplified specific fragment and five out of ten with suitable quality RNAwere positive for latency associated transcript. Conclusion: Some trigeminal ganglia did notshow evidence of infection and some had different HSV-1 infection status (active or latent)with inflammatory cells infiltrate in almost all samples. This is the first work that detectssimultaneously genome, proteins and LAT of HSV-1 in human trigeminal ganglia, leading toexplore findings about the latency and r eactivation pr ocess...
